PCR释疑

占国忠 （福建省莆田市  莆田市第一中学    351100）

郑  萍 （福建省莆田市  莆田市教师进修学院 351100）

    文章编号1005—2259(2014)9—0032—0

    在人教版高中《生物·选修3·现代生物科技专题》关于PCR的教学过程中，有几个问题经常困扰教师和学生，下面就列举这几个问题并解答。

1 引物如何保证特异性？

PCR中对引物的要求是最高的。为取得PCR的成功，首要条件是设计好引物^[1]。因为PCR的模板一般采用基因组DNA，所以设计引物最重要的是特异性要高。引物长度根据统计学计算，长约17个碱基的寡核苷酸序列在人的基因组中可能出现的机率为1次。因此，引物长度一般最低不少于16个核苷酸，而最高不超过30个核苷酸，最佳长度为20～24个核苷酸。但是如何直观了解某个引物特异性？可以登录NCBI (National Center of Biotechnology Information，美国国立生物技术信息中心）、CBI（Center for Bioinformatics，北京大学生物信息中心）或者EBI（European Bioinformatics Institute，欧洲生物信息研究所）等网站，上面有目前人类已经测得的各种生物基因组碱基序列数据库，还提供序列比对（BLAST）。可以将引物序列与基因组序列进行比对，从比对结果可以直观看出引物的特异性程度。

2   PCR的底物为什么不是脱氧核苷酸，能量为什么不是ATP提供？

    必修二课本54页关于体内DNA复制，文中是这样描述的：“以游离的4种脱氧核苷酸为原料”。受此误导，很多人认为PCR的底物也是4种脱氧核苷酸。事实上这句描述是错误的。不管是原核还是真核生物，DNA聚合酶能催化的底物都是4种脱氧核苷三磷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，或者统称dNTP。它们不能被相应的二磷酸或者一磷酸化合物所取代，也不能被核糖核苷酸所取代。所以不管是在细胞内还是细胞外，DNA复制所用的底物都是dNTP。dNTP在反应时会脱去焦磷酸（PPi）,形成磷酸二酯键所需要的能量来自α-与β-磷酸基之间高能键（即靠近脱氧核糖的高能磷酸键）的裂解^[1]。所以dNTP是PCR的底物，同时也是所需能量来源，不需要加入ATP来提供能量。

3  循环过程中会不会产生大量的非基因片段？

如图是PCR的原理简图。其中A和B代表模板DNA,a和b代表引物，A1和B1代表长产物片段，A2和B2代表短产物片段，即目的基因。从图中可以得出，第一次循环不会产生A2和B2，只有A1和B1，第二次循环才开始产生A2和B2，但是同时又产生A1和B1，所以有人认为A1和B1会比A2和B2多。其实不然，以A和B原始数量为1进行推导：A和B的数量是不会增加的；A1和B1只能以A和B为模板复制，所以每个循环它们只能增加1个；其余的都是A2和B2，所以我们可以列出表格如下。由此可知，PCR不会产生大量的非基因片段，而随着n的增大，A2和B2约等于2ⁿ，可以近似认为是指数增长的。

4  PCR是不是只能扩增已知序列？

    锚式PCR可以扩增未知序列。对于一个mRNA，如果只知道其中一小段序列信息，可以利用下游锚式PCR扩增其已知序列的3'端下游的未知序列，也可以利用上游锚式PCR扩增其已知序列的5'端上游的未知序列。以下游锚式PCR为例，扩增反应需要3个引物，进行一个逆转录反应和两轮PCR扩增。

    3个引物是：一个oligo(dT)引物，2个利用已知序列设计的序列特异性引物（引物1和引物2）。

整个过程包括逆转录、第一轮PCR和第二轮PCR三个部分。

逆转录是用oligo(dT)作为引物，因为真核生物的大部分mRNA都有多聚腺苷酸的尾巴，可以用oligo(dT)作为引物，合成cDNA第一链。

第一轮PCR是用引物1和oligo(dT)作为引物，因为oligo(dT)是非特异的，所以对靶序列扩增的特异性是靠引物1来控制的，这轮PCR的产物的特异性不能保证是唯一的。

第二轮PCR是用引物2和oligo(dT)作为引物，以第一轮的产物作为模板。在第二轮扩增中，不仅放大产物的量，而且通过引物2进一步提高扩增的特异性^[3]。

主要参考文献

[1]王镜岩,朱圣庚,徐长法.2002.生物化学第三版下册.北京:高等教育出版社,595,410-417

[2]李兴玉.2009.简明分子生物学.北京：化学工业出版社，111-112

发表于《中学生物教学》2014年第9期

CN:61-1256/G4

PCR释疑

作者简介：1占国忠（1981-），男，福建省莆田市第一中学，一级教师，硕士，zgz98003@163.com，13959511323  

    通讯地址：福建省莆田市第一中学（351100）  占国忠